BioWill?Lab懸浮培養CHO細胞及表達蛋白
時(shí)間是：2021-10-10 09:24:00 點擊次數：484
一、前期準備
1、 接種前五天左右，開始複蘇準備種子細胞。
2、 接種前四天左右，确認相關操作具體執行情況，如：測糖試劑盒、計數闆、滅菌的(de)培養基和(hé)葡萄糖及NaHCO3并做(zuò)檢菌（無菌檢驗，4天後如若無菌即可(kě)用(yòng)）、氣體鋼瓶等。PBS 800ml電極滅菌用(yòng)；無檢過的(de)細胞培養液5L及濃縮液500ml；300ml 7.5%NaHCO3及200g/L葡萄糖溶液300ml，儲存于4℃，在使用(yòng)時(shí)提前放入37℃恒溫室預熱(rè)。
3、 接種前三天，各氣體及減壓閥管路準備,管子用(yòng)耐壓管。
4、 接種前兩天，電極校準（準備4.01和(hé)7.0的(de)校準液放于室溫、兩根精度0.1的(de)溫度計、飽和(hé)Na2SO3溶液、兩杯冷(lěng)、熱(rè)水(shuǐ)，操作詳見說明(míng)書(shū)）。包好錫箔紙，放進滅菌罐裏，孔對(duì)準，滅菌罐包好錫箔紙高(gāo)壓滅菌。冷(lěng)卻後，待用(yòng)。
5、 接種前兩天，袋子檢查，所有耗材記錄批次、充氣檢漏（将所有卡闆卡死，塑料螺絲擰緊，充氣充到手指幾乎壓不下(xià)去），至少檢8h。
6、 接種前兩天，接頭、接種瓶、堿瓶、葡萄糖瓶等瓶塞管路接頭制備及滅菌。
7、 接種前一天裝罐，在超淨台内裝好PH、DO、T電極，并在台内連好酒精袋和(hé)取樣器，裝罐（詳見說明(míng)書(shū)），檢漏。
8、 接種前一天，打入500ml不含雙抗的(de)培養基到激流袋内開啓自動運行，隻通(tōng)低速空氣，維持系統正壓，檢菌24h。
二、細胞接種
9、 準備好細胞種子活率95%以上，密度爲2.0×10E6 cells/ml，500ml打入無菌的(de)接種瓶内，置于37度培養箱内。經檢菌确認無污染打出培養液，打入種子細胞，留少許檢菌，設置好參數，啓動自動運行狀态。
10、參數設置（PH:7.0-7.2,DO:30%-60%,T:37℃，轉速：75-85rpm），細胞培養開始後，20分(fēn)鐘(zhōng)左右取樣測糖和(hé)計數，作爲初始含糖量和(hé)細胞密度的(de)起始值。
三、細胞生長(cháng)期
11、前期培養（1-3天），一般24h取樣測糖和(hé)細胞計數一次，後期培養（4-6天），一般12h取樣測糖和(hé)計數一次，計算(suàn)出24小時(shí)内的(de)耗糖量，并做(zuò)出未來(lái)12小時(shí)的(de)耗糖預測，并提前準備補充培養基和(hé)葡萄糖，一般維持培養液的(de)殘糖在2g/L以上。計劃好每次細胞計數後補充的(de)培養液的(de)量，盡量采用(yòng)密度和(hé)體積同時(shí)上升，最終細胞生長(cháng)密度和(hé)體積差不多(duō)同時(shí)到達最大(dà)值。每次補加培養液不宜過多(duō)，以免細胞密度稀釋過低導緻生長(cháng)不起來(lái)。
四、蛋白表達期
12、當細胞培養到後期，細胞量達到一定，開始給予外界條件提高(gāo)表達。一般提高(gāo)表達的(de)方式有：1、降溫（28-32度）2、DMSO等試劑。根據耗糖情況适當補充濃縮液和(hé)葡萄糖補充營養。
五、下(xià)罐
13、當細胞活率低于80-85%時(shí)，代謝産物(wù)慢(màn)慢(màn)積累，乳酸含量會增加，可(kě)以考慮下(xià)罐，檢測每天取樣的(de)蛋白含量和(hé)後期純化(huà)。
