技術文章(zhāng)8 上遊工藝細胞培養放大(dà)需求和(hé)挑戰

　幾種常見的(de)懸浮培養和(hé)放大(dà)工藝方式，分(fēn)别是批次式培養、流加（補料）式培養基灌注式培養。批次式培養是指在生物(wù)反應器中一次性加入細胞培養基和(hé)接入細胞種子，在培養過程中除了(le)調節培養環境的(de)PH值和(hé)溶氧外，不補充培養基也(yě)不排出培養基，直至培養過程結束。批次式培養的(de)生長(cháng)代謝環境相對(duì)是一個(gè)固定環境，不添加任何營養成分(fēn)，能夠觀察細胞.
 
細胞生長(cháng)整個(gè)代謝過程。但由于初始營養物(wù)質比較豐富，可(kě)能會造成細胞早期過量利用(yòng)，進而積累大(dà)量的(de)代謝廢物(wù)，培養後期細胞生長(cháng)易受到抑制，生長(cháng)周期較短，細胞密度也(yě)不高(gāo)。流加（補料）式培養是指，細胞培養基不是一次性加入反應器中，而是根據細胞生長(cháng)代謝的(de)情況逐步補加營養成分(fēn)，維持葡萄糖、谷氨酰胺等關鍵營養物(wù)質，來(lái)維持合适的(de)平衡濃度，避免培養過程中出現營養限制和(hé)有毒代謝産物(wù)過量積累，以達到延長(cháng)細胞培養時(shí)間，增加細胞密度和(hé)提高(gāo)産物(wù)濃度的(de)目的(de)。灌注式培養是指将細胞和(hé)細胞培養基一起加入反應器中後，在細胞生長(cháng)和(hé)産物(wù)形成過程中，不斷的(de)流加新鮮培養基，同時(shí)通(tōng)過細胞截留裝置排除培養上清，而活細胞被截留在反應器中的(de)一種操作方式。培養基的(de)不斷流出，可(kě)帶走代謝副産物(wù)如乳酸、氨等，使其在培養液中維持低濃度水(shuǐ)平，避免成爲細胞生長(cháng)的(de)抑制因素，使細胞生長(cháng)在良好的(de)培養環境中，最終能獲得(de)較高(gāo)的(de)細胞培養密度和(hé)産物(wù)生産速率。因此，灌注式培養具有反應體積小，回收體積大(dà)，産品在罐内停留時(shí)間短，可(kě)及時(shí)回收到低溫條件下(xià)保存，有利于保持産品的(de)活性等特點，一般在小規模生物(wù)反應器的(de)條件下(xià)應用(yòng)比較多(duō)。不足之處是其操作流程比較複雜(zá)，細胞培養基利用(yòng)率低，工藝放大(dà)過程較爲困難，細胞截留裝置存在截留效率和(hé)堵塞等問題。


攪拌速率和(hé)通(tōng)氣策略作爲相對(duì)關鍵的(de)體積依賴性的(de)參數，在放大(dà)培養過程中會變爲公認的(de)難題。由于各型反應器的(de)攪拌方式、罐體設計和(hé)性能設計均有不同，因此，很難建立統一或者通(tōng)用(yòng)性的(de)放大(dà)模型。所以，需要從幾個(gè)方面進行全方面的(de)考量。攪拌策略和(hé)通(tōng)氣策略要相互配合，一方面通(tōng)過适當的(de)攪拌可(kě)以促進培養基中的(de)營養物(wù)質充分(fēn)混合，加強氣液傳質的(de)效果，達到理(lǐ)想的(de)培養環境；另一方面，在有效的(de)的(de)供給氧氣傳質的(de)同時(shí)，也(yě)可(kě)以一定程度上幫助排除溶解于培養液中的(de)二氧化(huà)碳，保證二氧化(huà)碳分(fēn)壓的(de)正常。不過，過高(gāo)的(de)攪拌轉速和(hé)過大(dà)的(de)氣體通(tōng)氣量，往往會帶來(lái)一定的(de)剪切力，在一定程度上可(kě)能會對(duì)細胞的(de)培養帶來(lái)負面的(de)影(yǐng)響。針對(duì)細胞培養放大(dà)過程中幾個(gè)常見因素，進行簡單介紹。


1、氧氣的(de)傳質
氧氣是細胞生存必不可(kě)少的(de)條件之一，細胞主要利用(yòng)的(de)是溶解在細胞培養液中的(de)氧。氣體中的(de)分(fēn)子态氧溶解在水(shuǐ)中稱爲溶解氧，簡稱溶氧，是表征水(shuǐ)溶液中氧濃度的(de)參數。溶氧也(yě)能在一定程度上反映細胞的(de)生理(lǐ)代謝變化(huà)和(hé)對(duì)産物(wù)合成的(de)影(yǐng)響，細胞在不同的(de)生長(cháng)階段對(duì)于氧的(de)需求也(yě)有所不同。氧氣的(de)供給和(hé)傳質是細胞培養過程中一個(gè)重要環節，穩定的(de)溶氧水(shuǐ)平，是維持細胞正常的(de)重要因素。通(tōng)常情況下(xià)，哺乳類動物(wù)細胞，都需要30%-40%的(de)溶氧水(shuǐ)平。利用(yòng)攪拌式的(de)生物(wù)反應器，對(duì)于較大(dà)規模或較高(gāo)密度的(de)細胞培養來(lái)說，細胞對(duì)于氧氣的(de)消耗速率較快(kuài)，氧氣需求量很大(dà)，通(tōng)常會采用(yòng)通(tōng)過微泡分(fēn)布器通(tōng)氣方式來(lái)維持較強的(de)氧氣傳質。微泡分(fēn)布器，作爲微米級的(de)氣體分(fēn)布器，是通(tōng)過增加氣泡的(de)表面積來(lái)提高(gāo)氧氣傳質系數。另外，大(dà)泡分(fēn)布器，作爲毫米級氣體分(fēn)布器，能夠帶來(lái)較大(dà)的(de)通(tōng)氣量 ，同時(shí)可(kě)以輔助氣體的(de)排除，因此常用(yòng)來(lái)通(tōng)入空氣以排除二氧化(huà)碳。通(tōng)過有效的(de)PH值以及溶氧值監測調控，配合泵系統的(de)整體控制，可(kě)以給細胞提供優良的(de)生長(cháng)環境。與此同時(shí)，随著(zhe)培養體積的(de)增大(dà)，反應器體積的(de)增加以及混合時(shí)間的(de)明(míng)顯增加，有可(kě)能帶來(lái)反應器内部溶氧水(shuǐ)平呈階梯化(huà)分(fēn)布。一般來(lái)說，溶氧水(shuǐ)平的(de)改變可(kě)能會影(yǐng)響細胞的(de)代謝水(shuǐ)平，如果較爲顯著的(de)改變還(hái)可(kě)能影(yǐng)響蛋白的(de)糖基化(huà)水(shuǐ)平，對(duì)于産品質量有所影(yǐng)響。因此，對(duì)于反應器攪拌效率的(de)考量也(yě)是一個(gè)較爲關鍵的(de)因素。


2、PH和(hé)CO₂的(de)控制
PH作爲一個(gè)重要的(de)工藝參數及控制參數，往往也(yě)會直接影(yǐng)響細胞表達産物(wù)的(de)質量。PH的(de)控制和(hé)調節在整個(gè)細胞培養的(de)過程中是一個(gè)動态的(de)過程。起始階段，接種前，接入新鮮培養基時(shí)，通(tōng)常需要讓培養基平衡一下(xià)，如果PH數偏堿性的(de)話(huà)，可(kě)以适量通(tōng)入二氧化(huà)碳來(lái)平衡PH，爲接種細胞做(zuò)準備。培養過程中代謝的(de)乳酸和(hé)通(tōng)氣中的(de)二氧化(huà)碳，會使培養液中的(de)PH一定程度的(de)下(xià)降，因而需要補充堿液（例如NaHCO₃ 、NaCO_3等）來(lái)實現一個(gè)有效的(de)調節。對(duì)于堿液濃度的(de)選擇及補堿液的(de)位置也(yě)很重要，如果造成局部PH過高(gāo)，有可(kě)能會導緻細胞裂解，影(yǐng)響培養結果，因此，通(tōng)常情況下(xià)，會選擇低濃度的(de)堿液來(lái)進行控制。由于是外加的(de)溶液，也(yě)要考慮滲透壓的(de)影(yǐng)響，應盡可(kě)能的(de)降低堿液對(duì)滲透壓的(de)增加，同時(shí)需平衡對(duì)二氧化(huà)碳分(fēn)壓的(de)控制。二氧化(huà)碳的(de)控制，在放大(dà)培養過程中，二氧化(huà)碳的(de)排除一直是較爲麻煩的(de)環節。二氧化(huà)碳相對(duì)于氧氣而言，在液體中的(de)溶解度比較高(gāo)。細胞每消耗一份子氧氣，便會産生一份子二氧化(huà)碳，經過一段時(shí)間的(de)積累，二氧化(huà)碳的(de)濃度會上升。當反應器中單位二氧化(huà)碳濃度達到15%-20%時(shí)，會對(duì)細胞産生毒害作用(yòng)，因此一般會加入一定量的(de)NaHCO₃作爲緩沖體系。但當二氧化(huà)碳濃度遠(yuǎn)超過緩沖體系的(de)緩沖能力時(shí)，就需要考慮利用(yòng)通(tōng)氣量、氣泡尺寸等多(duō)種因素共同控制，從而有效地排除二氧化(huà)碳。實踐證明(míng)，增大(dà)深層通(tōng)氣量或使用(yòng)大(dà)泡分(fēn)布器可(kě)以顯著降低二氧化(huà)碳分(fēn)壓，而改變攪拌轉速或者增加表層通(tōng)氣量對(duì)二氧化(huà)碳分(fēn)壓影(yǐng)響較小。


3、混合效果
與混合效果較爲相關的(de)兩個(gè)部分(fēn)分(fēn)别爲，通(tōng)過攪拌混合達到氣體與液體的(de)充分(fēn)接觸，并形成穩定的(de)氣體傳質；通(tōng)過攪拌混合使得(de)液體中的(de)有效成分(fēn)濃度在整個(gè)體系中呈均勻分(fēn)布，從而達到一個(gè)穩定的(de)液體培養環境。爲了(le)實現良好的(de)混合效果，對(duì)于反應器的(de)整體設計有一定的(de)要求。對(duì)于較大(dà)體積生物(wù)反應器來(lái)說，其目的(de)都是爲了(le)能夠實現整體培養環境中的(de)穩定和(hé)均一。另外一個(gè)決定混合效果的(de)因素書(shū)攪拌方式。上攪拌、下(xià)攪拌、有無軸封、斜攪拌、直攪拌等，不管選擇哪種方式，最終的(de)目的(de)是在盡可(kě)能少的(de)對(duì)細胞造成損傷的(de)前提下(xià)，最大(dà)程度提供有效的(de)攪拌效果。采用(yòng)不同形狀的(de)攪拌槳會帶來(lái)攪拌的(de)差異性，不同形式的(de)攪拌均有對(duì)于攪拌效果的(de)測試，依據實際需求可(kě)以做(zuò)出選擇。


4、剪切力
  一般在細胞培養過程中提到的(de)剪切力按照(zhào)來(lái)源大(dà)緻可(kě)以分(fēn)爲兩類：攪拌相關和(hé)通(tōng)氣相關。攪拌相關的(de)剪切力主要指由于攪拌槳運動所産生的(de)流體剪切力，可(kě)能會對(duì)細胞産生一些物(wù)理(lǐ)性的(de)損傷，嚴重的(de)可(kě)能會導緻細胞死亡。也(yě)有實例中發現，流體剪切力可(kě)能會對(duì)抗體的(de)糖基化(huà)水(shuǐ)平有一定的(de)影(yǐng)響。不過通(tōng)常來(lái)說，細胞反應器内的(de)平均能耗還(hái)是相對(duì)比較低的(de)，排除一些物(wù)理(lǐ)性的(de)因素之外（如攪拌軸自身材質或設計），流體剪切力對(duì)于細胞的(de)影(yǐng)響還(hái)是比較小的(de)。
關于通(tōng)氣相關剪切力，根據氣泡的(de)形成周期來(lái)分(fēn)析，可(kě)能對(duì)細胞的(de)造成影(yǐng)響可(kě)簡單分(fēn)成四個(gè)階段：氣體分(fēn)布器處氣泡的(de)形成；攪拌槳處氣泡的(de)合并與碰撞破裂；反應器内氣泡上升；氣液交換處或接觸面氣泡的(de)碰撞破裂。根據實際經驗，氣液交界面氣泡破裂是導緻細胞損傷的(de)剪切力的(de)主要來(lái)源，其他(tā)方向相對(duì)來(lái)說影(yǐng)響較小。采用(yòng)不同孔徑的(de)氣體分(fēn)布器以及改變分(fēn)布器與攪拌槳的(de)相對(duì)位置也(yě)會帶來(lái)不同影(yǐng)響，具體問題需要具體分(fēn)析。
 
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