BioWill?系列生物(wù)反應器生産貝伐珠單抗工藝探索

　 1.1 工程細胞的(de)制備
        将重組全人(rén)源抗CD20單克隆抗體基因轉入宿主細胞（中國倉鼠卵巢細胞CHO-S），經過篩選、鑒定，得(de)到重組工程細胞。細胞庫的(de)建立、傳代及保存、細胞檢定均符合《中國藥典》現行版“生物(wù)制品生産檢定用(yòng)動物(wù)細胞基質制備及檢定規程”的(de)規定。
細胞複蘇後于36.5℃、6% CO2、130 r/min條件下(xià)培養，細胞凍存1.5ml/支于液氮或-130℃以下(xià)保存。細胞外源因子檢查應爲陰性，細胞爲圓形，懸浮生長(cháng)，倍增時(shí)間爲16～40 h；采用(yòng)同工酶圖譜分(fēn)析和(hé)染色體特征分(fēn)析，應與CHO細胞相同；細胞庫應與CHO具體相同成瘤性特征；表達産物(wù)應有生物(wù)學活性；目的(de)基因核苷酸序列應與理(lǐ)論設計序列一緻。
 
1.2 原液的(de)制備
 
1.2.1 細胞複蘇與搖瓶種子擴增
 
從液氮罐中取出 1 支凍存的(de)工作細胞庫細胞， 37℃水(shuǐ)浴複蘇後，用(yòng)種子培養基接種至搖瓶中，于 130 rpm、36.5℃、6% CO₂ 條件下(xià)培養，培養2～4天後進行細胞傳代擴增，直至細胞數量滿足WAVE培養的(de)要求。
 
1.2.2 BioWill™Wave反應器種子培養
 
将搖瓶種子接種入種子培養基中，培養條件爲36.5±0.5℃、搖動角度8º、搖動速度18 r/min、表通(tōng)90～95%空氣和(hé)10～5% CO2。當WAVE 反應器内細胞密度達到 2×10⁶cells/mL~5×10⁶cells/mL，活率90%以上時(shí)，進行 50 L 生物(wù)反應器接種。
 
1.2.3 BioWill™SUS50 L生物(wù)反應器種子培養
将wave種子接種入種子培養基中，培養條件爲36.5±0.5℃、pH 7.0±0.1、DO 20%～80%、轉速70～100 r/min。當反應器内細胞密度達到 2×10⁶cells/mL~5×10⁶cells/mL，活率90%以上時(shí)，進行下(xià)一步流加培養。
 
1. 2.4  BioWill™SUS 250 L生物(wù)反應器種子 流加培養
 
按照(zhào)0.8～1.2×10⁶cells/mL的(de)密度接種，前期細胞生長(cháng)期培養溫度爲36.5℃，攪拌速度70～150 r/min，DO 40%，pH 6.95±0.15，當細胞進入後期表達期時(shí)進行降溫至33℃。
 
從培養第3天開始，将總量爲初始培養體積20%的(de)流加培養基進行連續性流加。每天取樣，監測各培養參數和(hé)生化(huà)指标，當葡萄糖濃度低于2.5 g/L時(shí)，補加葡萄糖濃縮液使葡萄糖濃度提高(gāo)至4 g/L。當泡沫高(gāo)于液面5 cm時(shí)，補加消泡劑稀釋液。細胞培養周期爲 12～15天。
 
1.2.4 收獲
 
待細胞培養結束後，收獲上清液至下(xià)遊純化(huà)。
 
 
1.2.5  純化(huà)
 
工藝流程圖如下(xià)：
  1.2.5.1 澄清過濾
      采用(yòng)millipore的(de)兩級深層過濾膜包（D0HC和(hé)X0HC）以及Sartorius的(de)除菌過濾器對(duì)收獲液進行澄清過濾，過濾完成後用(yòng)平衡緩沖液沖洗膜包。
1.2.5. 2 親和(hé)層析
 
采用(yòng)GE的(de)Mabselect SuRe填料，用(yòng)親和(hé)平衡緩沖液（20mM Tris-150mM NaCl，pH 7.2）沖洗層析柱5CV，待基線平穩後調零上樣，上樣完畢後用(yòng)親和(hé)平衡緩沖液沖洗5CV；用(yòng)親和(hé)洗脫緩沖液（100mM枸橼酸-枸橼酸鈉，pH 3.5）開始洗脫，收集紫外280nm處的(de)主峰，收集液用(yòng)2 M Tris調pH至6.5±0.3，除菌過濾2～8℃保存。
 
1.2.5.3 低pH病毒滅活
       将親和(hé)收集液用(yòng)0.5M枸橼酸調pH至3.5±0.2，蛋白濃度＜24 mg/ml，于 18～26℃下(xià)靜置90 min，然後用(yòng)2 M Tris調pH至6.5±0.3，除菌過濾2～8℃保存。
 
1.2.5.4 陽離子交換層析
将親和(hé)收集液用(yòng)陽離子平衡緩沖液（20 mM枸橼酸-枸橼酸鈉，pH 5.0）稀釋≥5倍。采用(yòng)Merck Fractogel EMD SO₃^-(M)填料，陽離子平衡緩沖液沖洗層析柱5CV，待基線平穩後調零上樣，上樣完畢後用(yòng)陽離子洗脫緩沖液（A：20 mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.0和(hé)B：272 mM醋酸-醋酸鈉，pH 5.9）分(fēn)别洗脫，收集紫外280nm處主峰，收集液除菌過濾2～8℃保存。
 
1.2.5.5 陰離子交換層析
用(yòng)2 M Tris調節陽離子收集液至pH 7.2±0.2。采用(yòng)GE Q Sepharose Fast Flow填料，陰離子再生緩沖液（20 mM Tris-1M NaCl，pH 8.0）沖洗層析柱3CV，陰離子平衡緩沖液（20 mM Tris，pH 8.0）沖洗層析柱5CV，待基線平穩後調零上樣，收集紫外280nm處主峰，收集液用(yòng)2M枸橼酸調節pH至5.0～6.0，除菌過濾2～8℃保存。
 
1.2.5.6 超濾濃縮
采用(yòng)millipore的(de)Pellicon2超濾膜，用(yòng)超濾平衡緩沖液（10 mM Tris-80 mM 醋酸鈉，pH6.5）潤洗系統後上樣，連續換液濃縮至蛋白濃度爲9～15mg/ml爲止，收集液除菌過濾後2～8℃保存。
 
1.2.5.7 除病毒過濾
采用(yòng)Millipore的(de)VPF預過濾器和(hé)Viresolve Pro除病毒過濾膜包，用(yòng)除病毒過濾緩沖液（10 mM Tris-80 M 醋酸鈉，pH6.5）潤洗膜包。收集過濾液，2～8℃保存。
 
1.2.5.8 原液制備
将超濾收集液，用(yòng)工藝緩沖液（7.35 g/L枸橼酸鈉，9 g/L氯化(huà)鈉，35 g/L聚山梨酯80，pH6.5）按照(zhào)1:49的(de)體積比混合，混勻後除菌過濾，分(fēn)裝于儲液袋中-30℃保存。